【手性分离技术 8.】
（8. 高效手性分离技术④）
手性超临界色谱（SFC）：
超临界流体色谱原理： 当物质处于两相或三相平衡时的临界点的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）表征物质相变的临界状态。当流体的温度和压力在临界温度和临界压力上时的状态成为超临界流体。当流体处于超临界状态时，气液面消失，非液非气，具有和气体类似的高扩散系数和较低的粘度，同时密度和溶解力又与液体接近。由于这些独特的性质，使得超临界流体在色谱分析、化学反应、环境保护、萃取分离、材料制备、医药工业等领域都具有较为广阔的应用前景。物质相图如下。
图. 纯物质的相图
在众多的超临界流体中，CO2的临界温度为31.1℃，比较溶剂达到，而且临界压力为7.39 MPa，相对较为适中，而且CO2来源较易，并且无毒不具有燃烧性，成为最广为使用的一种流体。目前使用较多的超临界液体就是以CO2为超临界液体。
超临界流体色谱（supeicriticalfluid chromatography，简称SFC）：即以超临界流体为流动相，以固体吸附剂（如硅胶、氧化铝）或键合在载体（或毛细管壁）上的高聚物为固定相的一种新型色谱分离技术，色谱仪器主要包括高压流动相传送系统、色谱分离系统和检测系统三个部分。
用超临界流体做流动相是1962年首先提出的，成功的分离了卟啉衍生物。但由于当时实验技术上的困难，仪器较为复杂，且无商品仪器供应，因而发展缓慢。直到1981年毛细管柱超临界流体色谱的发展，这一技术得到了迅猛的发展，研究论文也大量增加，美国和其他一些国家的科学公司相继推出超临界流体色谱的商品仪器。
超临界流体色谱具有如下特征：（1）超临界流体的粘度与气体相似，不到液体粘度的1%，阻力较小，在相同条件下，压力降低于液体色谱；流体的扩散系数介于气体和液体之间，扩散系数和传质速率较高，分离操作时间短，单位时间内分离效能高。可用于分离选择性要求较高的手性对映体。（2）超临界流体密度与液体相似，具有较强的溶解能力，同时分离得到的产品易于脱离溶剂，后处理简单。（3）SFC可与大多数通用型HPLC多种检测器匹配，还可与质谱、核磁共振仪等大型仪器联用，在定性、定量检测中使用极为方便。
SFC有着处理量大，污染小，时间短，溶剂使用量少等优点，被人称为“绿色科技”。操作体系的压力、温度，流动相的密度、粘度，溶剂的选择等都会影响分离效果，因此SFC所需的流动相主要是超临界CO2，超临界CO2比普通的CO2有更强的洗脱能力。当然，在很多分离过程中，单纯靠超临界CO2是很难分离的，所以往往会加入一些极性助剂，比如:乙醇、丙酮。
SFC对固定液的要求，首先是抗溶剂冲刷，即在大量溶剂冲淡、加压和减降，体积膨胀和收缩后，液膜稳定性好；其次是化学稳定性好，选择性高，即固定相不与组分起化学反应，且带有一定基团，呈现出选择性；再次是热稳定性好，使用温度范围较宽。
超临界流体色谱手性分析：1985年，Mourier等首次采用SFC拆分手性化合物。Guiochon等应用SFC分离了80种手性化合物，取得了良好的分离效果。Novell等将寡糖聚合脯氨酸手性柱应用在SFC对映异构体拆分中。Nelander等应用OD分离了20种手性化合物，发现7种化合物在HPLC上的选择因子要高于SFC，说明SFC和HPLC的分离表现出一定的互补性。
采用超临界流体色谱技术，可在Enantiopak OD柱上建立一种快速定量检测黄瓜和西红柿等样品中灭菌唑手性异构体残留的分析方法，深入研究了有机改性剂(MeOH、EtOH和ACN)及比例等因素对灭菌唑的对映异构体分离、SFC上标准溶液及不同基质溶液中定量的影响。采用QuEChERS前处理技术对黄瓜和西红柿等样品中的灭菌唑进行提取和富集，在灭菌唑浓度为0.01-1mg/mL的范围内，两种灭菌唑的手性异构体的浓度与色谱峰面积间呈现良好的线性关系(r2≥0.9988)；在黄瓜和西红柿等基质中，灭菌唑异构体的平均回收率在81.62%-106.21%的范围内，RSD≤7.30%，这种基于SFC对手性异构体进行分析检测的方法具有良好的准确度和精密度，有望应用在手性农药异构体的快速分析检测和评价。
超临界流体色谱在手性分离上的应用：在SFC中，制备型色谱用的比较多的是多糖类衍生物固定相，因为多糖类衍生物固定相的上样量比较大。制备型SFC比一般分析型液相色谱法上样量多几十倍、几百倍甚至更多，分离时间少2-8倍，溶剂消耗量少一半，因此，研究者们一直努力把SFC做上工业化。
在超临界CO2流体中常添加改性剂作为流动相，以增强流动相的极性和酸碱性从而提高分离效果。改性剂比例不同会对分离效果有直接影响，早在2012年，用手性色谱柱Lux Cellulose-2分离手性吲哚类物质时发现，随着改性剂甲醇比例从5%增加到20%，吲哚类物质的logk值从0.2下降至-0.3，loga值从0.23下降至0.16，保留因子、选择因子都降低。为了更加全面探究比较改性剂对分离效果的影响，后在2014年时报道了在手性色谱柱Chiral pak AD-H和Lux Cellulose-1中使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇五种醇类改性剂，探究了不同醇类改性剂对对映异构体分离的差异性。实验结果表明：相比于其他醇类改性剂而言，甲醇作为改性剂可以实现更多物质的基线分离；碳链越短的醇应用于淀粉类的固定相中（Chiralpak AD-H）可以提高选择因子，然而在纤维素类的固定相中（LuxCellulose-1）却是降低。
有研究综述了在分离癸烷异构体时，背压升高，保留因子减小；在分离洛芬类化合物时，背压升高，选择因子基本不变。后在使用Chiralcel OD-H分离TSO时，借用范德姆特方程H=A+B/u1.5+Cu1.5阐述了流速对分离效果的影响，发现随着流速从1ml/min增加到4ml/min时，理论塔板高度H从15.3μm先减小到14.0μm后增加到23.5μm。同时也发现了随着流速增加出峰时间变快，分离度先增后减的现象ΔRsmax=1.22。然而对于溶解样品时所用溶剂的不同导致分离结果的差异性尚未见报道。采用EnantiopakOD手性柱，应用超临界流体色谱（SFC）技术，以乙醇：二氧化碳=10:90（v/v）为流动相时，比较了超临界流体色谱（SFC）与高效液相色谱（HPLC）对灭菌唑对映异构体拆分的差异性，以Rs/t2值表示分离效率，通过相比较两者的Rs/t2值，发现灭菌唑在SFC中的分离效率是在HPLC中的3.5倍。
综上所述：SFC作为制备色谱，有着比普通制备色谱样品处理量大，污染小，时间短，溶剂使用量少等优点，被人称为“绿色科技”。环糊精类和多糖类手性固定相是近几年在SFC中用的最多的，尤其是多糖类，因为其上样量比较大。超临界流体色谱可以不仅可以使用高效液相色谱的检测器，可与气相色谱、质谱、傅里叶红外光谱等仪器在线联接，因而可方便地进行各种定性和定量分析。制备型SFC比一般制备液相色谱法上样量多几十倍、几百倍甚至更多，分离时间少2-8倍，溶剂消耗量少一半。由于对工业化规模的超临界状态的条件的控制不易实现，因此工业化规模的色谱制备尚无报道先例。
丰都智愚河畔环境技术工作室
